革兰氏染色步骤

革兰氏染色：介绍细菌世界的阴阳之分

在微观世界的细菌家族中，有一种神秘的染色技术，可以让研究者轻松识别出革兰氏阳性菌（G⁺）和阴性菌（G⁻）。这项技术就是革兰氏染色，堪称细菌学中的“阴阳鉴别术”。下面，我们将详细介绍这种技术的操作流程、关键原理以及需要注意的事项。

一、操作步骤详解

1. 涂片：在洁净的载玻片上，轻轻滴加无菌水或蒸馏水，使用接种环挑选鲜活的菌体，与水滴混合，均匀涂布成薄片。

2. 干燥与固定：将涂好的载玻片置于室温下自然晾干，或在酒精灯火焰上方微微加热烘干。固定时，将载玻片快速通过火焰3-4次，确保菌体牢固附着在载玻片上。

3. 初染：滴加草酸铵结晶紫染液，覆盖菌膜进行染色，染色时间约1-2分钟。染色完成后，用流水轻轻冲洗。

4. 媒染：接着滴加碘液（如革兰氏碘液），作用时间1分钟。这时，会形成结晶紫-碘复合物，使细菌更容易区分。然后，用水洗去多余的碘液。

5. 脱色：这是区分革兰氏阳性菌和阴性菌的关键步骤。使用95%的乙醇进行脱色，时间约20-45秒，或者直到流出的乙醇无色为止。立即用水洗终止脱色过程。

6. 复染：脱色完成后，滴加沙黄（或番红）染液进行复染，时间1-3分钟。复染的目的是增强对比，使细菌更容易观察。

7. 镜检：将载玻片放置在油镜下观察。革兰氏阳性菌呈现紫色，而阴性菌则呈现红色。

二、关键原理剖析

革兰氏染色技术的关键在于细胞壁的差异和染色选择性。G⁺菌的细胞壁厚且肽聚糖含量高，在脱色过程中会脱水收缩，保留结晶紫-碘复合物；而G⁻菌的细胞壁则相对薄，脂质较多，脱色时脂质溶解，复合物被洗脱。复染的过程则是通过红色染料覆盖脱色后的G⁻菌，进一步增强了细菌的对比性。

三、操作注意事项

在进行革兰氏染色时，需要注意以下几点：

1. 选用对数生长期的菌体进行染色，因为老化菌的细胞壁可能会发生变化，导致假阴性结果。

2. 脱色时间是关键，需要精准控制。时间过长可能导致G⁺菌脱色，时间过短则G⁻菌未能充分脱色。

3. 碘液需要新鲜配制，避免氧化失效。

掌握革兰氏染色的标准化操作与原理，就能准确区分细菌的革兰氏属性，为后续细菌鉴定和抗生素选择提供重要依据。在这神奇的染色术中，我们得以窥见微观世界的奥秘，感叹科学的魅力。